培养基是人工配制的适合微生物生长的基质。根据培养基原料物质的来源可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基三类。以培养基的物理状态又可划分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基。在蛹虫草的菌种制备和栽培中大都使用天然培养基和半合成培养基，制备二级种和栽培种可使用液体培养基，而人工栽培目前都采用固体培养基。
1.常用配方母种培养基主要用于菌种的分离、扩大、保藏。常用的配方有：
(1)马铃薯200g葡萄糖20g磷酸二氢钾2g硫酸镁1g琼脂20g水1000mlpH6～7(2)麸皮100g马铃薯100g磷酸二氢钾1g硫酸镁0.5g蛋白胨5g琼脂20g蔗糖20g水1000mlpH6.0～7.0(3)蛋白胨2g玉米楂50g葡萄糖5g黄豆饼粉lg蚕蛹粉5g磷酸二氢钾lg硫酸镁0.5g琼脂20g水1000mlpH6～7(4)麦芽汁100ml葡萄糖10g蛋白胨2g蚕蛹粉20g硫酸二氢钾lg硫酸镁0.5g琼脂20g水1000ml(5)马铃薯200g麸皮50g蛋白胨2g酵母膏lg
磷酸二氢钾lg维生素B1少量琼脂20g蔗糖10g葡萄糖10g酵母膏2g硫酸镁0.5g水1000ml硫酸镁0.5g水1000ml玉米楂30g黄豆饼粉20g磷酸二氢钾lg亚硫酸铁O.Olg琼脂20g。
2.制备方法母种培养基的制备程序如下：
（1）称量按培养基配方计算，准确称量各种物质。
（2）煮制取汁蛹虫草培养基中都有天然物质，如马铃薯、麸皮、豆饼等。制备培养基之前，先要煮制取汁，即将这些天然物质放入一定量的水中煮沸之后，用文火维持15～20分钟，过滤即可。
（3）溶解将营养物质加入一定量的水中，然后加热使其溶解。如配制固体培养基，在琼脂溶化的过程中要不断搅拌，并控制火源以防培养基溢出或烧焦，待完全溶化后，补足所失水分。如果培养基配方中有淀粉一类的物质，则要先用少许冷水将淀粉调成糊状，并在火上加热搅拌，再加入所需水分及其他物质，待完全溶化后，补足所失水分。
（4）测定并调整酸碱度制备蛹虫草培养基时，通常将pH调至6.5～7.5，灭菌后为6.0～7.0。
（5）过滤各种物质溶解之后，用3～4层纱布过滤。
（6）分装将制备好的培养基趁热分装入试管或三角瓶内。分装时，装入量以试管高度的1/5左右为宜。分装三角瓶时，以不超过三角瓶容积的一半为合适。分装时不要使培养基粘在管（瓶）口上，以免引起污染。
（7）加棉塞培养基分装后，要塞上棉塞。棉塞要松紧适度，塞入长度为棉塞总长度的2/3左右，使之既有利于通气，又可防止杂菌侵入，且拔取方便。
（8）包扎与灭菌塞好棉塞后，将试管每7支捆扎成一束或放入试管篮内，在外面包一层牛皮纸或薄膜，进行灭菌。培养基灭菌条件一般为121～126℃，20～30min。
（9）冷却与摆斜面灭菌后在灭菌器压力表的指针回到零之后，便可慢慢打开灭菌器，取出试管搁成斜面，使斜面长度为试管的2/3为好。待凝固后就成斜面培养基。为了检查灭菌是否彻底，将斜面培养基放在37℃温度下培养48小时，若无杂菌菌落方可使用。
