1.斜面菌种斜面菌种在使用前必须转接活化2～3次，要充分保证其纯度和较强的活力。
2.摇瓶菌种在无菌条件下，从斜面菌种中挑4～5块黄豆粒大小的含有菌丝体的培养基，接入已灭菌而盛有100ml液体培养基的500ml的三角瓶内，在22℃条件下，在摇床上振荡培养7～10天。采用往复式振荡机，振荡频率100次/min；采用旋转式振荡机，偏心距40mm，频率为150次/min。
3.一、二级种子罐培养将已培养好的摇瓶菌种，注入装有小玻璃珠的无菌瓶中进行剧烈振荡（振动频率为200次/min），以便将菌丝体打碎制成种子悬浮液。然后按10%的接种量接入一级发酵罐内进行培养，在22℃条件下培养10天左右，再由一级种子罐按10%接种量压入二级种子罐，在相同条件下培养相同时间后再压入三级种子罐培养。
4.发酵罐培养发酵罐有通用发酵罐和自吸式发酵罐两种。一般多采用后者。自吸式发酵罐是利用搅拌装置转动时所产生的负压自动吸入无菌空气，因此不需要空气压缩机，这种类型的发酵罐吸入的空气集中在搅拌器的中心部位，叶轮转动时能使气液两相充分混合，溶氧系数高，因而发酵较快，接种量为10%～30%，在22℃培养10～15天即可。另外江苏理工大学生物工程研究所研制的气流搅拌式发酵罐用于蛹虫草液体发酵效果甚佳。它可以减少搅拌（机式）对菌丝的损伤，而且增加了氧溶量，有利于菌丝的快速生长。
5.其他工艺条件蛹虫草液体深层发酵，要求罐温23～26℃，最适25℃；罐压0.4～0.8kg/cm2；通气量为0.5～0.8V/v/m；搅拌条件：50L罐40～50r/min；500L罐为120～250r/min；500L为200r/min。
6.发酵中间检查在蛹虫草的液体深层发酵过程中，为了保证菌种的质量和掌握菌丝的生长情况，需要进行中间检查。主要检查项目有：
（1）纯度检查为了检查菌种的纯度，需定期抽样，通过平板及酚红肉汤培养，油镜检查，以观察有无细菌和霉菌污染。
（2）活力检查通过显微镜观察蛹虫草菌丝球的大小，菌丝球的边缘，菌丝的粗细、分枝、着色程度，菌泥的下沉来判断菌丝的活力。
（3）其他测定主要有发酵醪的残糖量（不超过1.2%），氨态氮（不超过30mg/ml），菌丝体重量、菌泥重量（g）与醪液体积（L）之比等。
